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2023-08
所謂基因遞送系統,指的是一套能将基因片段定向投送到特定器官、組織和細胞中的系統。對于很多疾病的預防和治療來(lái)說(shuō),一套精确和高效的基因遞送系統往往起到關鍵的作(zuò)用。
如(rú)果一種疾病的發生(shēng)是因爲人(rén)體(tǐ)中某個重要基因出現了缺陷,例如(rú)很多單基因遺傳病,那麽如(rú)果利用基因遞送系統将正常基因序列送入這些細胞,就(jiù)有可(kě)能徹底治愈這些疾病。相(xiàng)反,也有不少疾病可(kě)能和某種基因的過度活躍相(xiàng)關,這個時候如(rú)果能利用基因遞送系統将幹擾該基因表達的工(gōng)具送入細胞,例如(rú)CRISPR/cas9等基因編輯工(gōng)具,也有可(kě)能起到釜底抽薪的效果。
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LNP和病毒載體(tǐ)
目前已經被深入開發和廣泛利用的基因遞送系統的種類繁多,但(dàn)主流大(dà)概是這麽兩大(dà)類:基于脂質體(tǐ)納米顆粒(LNP,lipid nanoparticles)的遞送系統,和基于病毒的遞送系統。下面我們将會簡單介紹下兩套系統。
我們先說(shuō)基于LNP的遞送系統。這套系統在新冠大(dà)流行之後變得(de)廣爲人(rén)知,因爲大(dà)流行中使用最爲廣泛的幾款mRNA疫苗使用的都(dōu)是這套遞送系統。其工(gōng)作(zuò)原理(lǐ)簡單來(lái)說(shuō)就(jiù)是,将編碼新冠病毒刺突蛋白(bái)的RNA片段包裹在空心的脂質體(tǐ)納米顆粒中,再注射入人(rén)體(tǐ),這些納米顆粒就(jiù)可(kě)以和人(rén)體(tǐ)細胞融合,将RNA片段送入人(rén)體(tǐ)細胞并生(shēng)産刺突蛋白(bái),從(cóng)而激發人(rén)體(tǐ)對新冠病毒的免疫記憶。
可(kě)想而知,這套基因遞送系統的用途當然不僅僅是新冠,目前已經有多家公司利用這一技術(shù)路(lù)線開發針對其他(tā)病原體(tǐ)的疫苗,例如(rú)流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、帶狀疱疹病毒(VZV)、巨細胞病毒(CMV)等。不少産品已經進入了臨床試驗階段[1]。
除了開發疫苗,基于LNP的基因遞送系統還(hái)有更廣泛的想象空間。例如(rú)Moderna公司也試圖用LNP遞送系統将編碼細胞因子白(bái)介素12(IL-12, interleukin-12)的RNA片段投送到腫瘤組織内部,讓腫瘤細胞生(shēng)産和分(fēn)泌IL-12,刺激腫瘤微環境中的免疫反應,起到殺傷腫瘤的作(zuò)用[2]。2021年(nián),Intellia公司也使用LNP遞送系統,治療一種先天單基因遺傳病,轉甲狀腺素蛋白(bái)澱粉樣變性。他(tā)們将靶向人(rén)體(tǐ)TTR基因的CRISPR/cas9基因編輯工(gōng)具投送到患者肝髒中,破壞其體(tǐ)内過度活躍的TTR基因表達,且觀察到了顯著且持續的臨床效果[3]。
我們再說(shuō)說(shuō)基于病毒的基因遞送系統。這其實是一個很古老的思路(lù),人(rén)們很早就(jiù)意識到病毒在感染宿主細胞的時候會将病毒内部的遺傳物質送入宿主細胞中,這些來(lái)自(zì)病毒的基因片段會在宿主細胞内啓動蛋白(bái)質生(shēng)産并參與新一代病毒顆粒的組裝。
以我們都(dōu)非常熟悉的新冠病毒爲例,在它感染宿主細胞後,新冠病毒内部包裹的一條由大(dà)約3萬個堿基組成的單鏈RNA分(fēn)子也會随之進入細胞,這條單鏈RNA分(fēn)子編碼了多種蛋白(bái)質,其中既有新冠病毒的重要結構單元例如(rú)病毒表面的刺突蛋白(bái),也有參與新冠病毒複制的重要蛋白(bái),例如(rú)RNA聚合酶。那麽既然如(rú)此,如(rú)果對天然的病毒加以改造,将人(rén)們希望遞送的基因片段放(fàng)進病毒基因組序列之中,自(zì)然就(jiù)可(kě)以實現特定基因的定向投送。
早在人(rén)類第一次嘗試基因治療——也就(jiù)是将特定基因片段送入因基因缺陷而導緻的疾病患者體(tǐ)内時,使用的就(jiù)是經過改造的病毒載體(tǐ)。在1990年(nián)代,研究者們使用逆轉錄病毒(Retrovirus)将完整的腺苷脫氨酶基因(ADA,adenosine deaminase)導入患者的免疫細胞中,用于挽救患者免疫細胞的功能,治療先天性的重症聯合免疫缺陷症(SCID)[4]。最早接受這種治療的一位患者在10年(nián)回訪中仍然有多達20%的淋巴細胞在持續表達ADA基因,并且得(de)以維持基本健康的生(shēng)活[5]
一直到今天,人(rén)們仍然在廣泛的使用各種病毒遞送系統用于治療疾病。目前歐美市場上獲批的基因治療産品,絕大(dà)多數都(dōu)是基于病毒載體(tǐ)的。例如(rú)Bluebird Bio公司的産品Zynteglo,利用慢(màn)病毒(Lentivirus)載體(tǐ)治療地中海貧血症;諾華公司的Zolgensma,利用腺相(xiàng)關病毒(AAV,adeno-assciated virus)治療脊髓性肌萎縮症(SMA);PTC Therapeutics公司的Upstaza,利用AAV載體(tǐ)治療芳香族 L-氨基酸脫羧酶缺乏症(AADC);等等。目前還(hái)在臨床開發中的其他(tā)類别的病毒載體(tǐ)也有不少。例如(rú)Krystal Therapeutics公司利用單純疱疹病毒載體(tǐ)(HSV-1),将7型膠原蛋白(bái)基因投送到患者皮膚組織中,治療因該基因缺陷導緻的隐性營養不良性大(dà)疱性表皮松解症(RDEB),在臨床試驗中取得(de)了很不錯的療效[6]
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基因遞送系統的靶向性問(wèn)題
那麽這些基因遞送系統有沒有什麽潛在的技術(shù)問(wèn)題呢(ne)?
當然有,這些運載工(gōng)具本身(shēn)的毒副作(zuò)用就(jiù)是非常值得(de)重視的問(wèn)題。LNP載體(tǐ)往往有較強的免疫原性,例如(rú)新冠mRNA疫苗注射後往會引起很大(dà)比例的發燒、疲勞、注射部位疼痛等副作(zuò)用。病毒載體(tǐ)也有可(kě)能激發強烈的免疫反應。例如(rú)1999年(nián),一位年(nián)輕患者在接受基于腺病毒載體(tǐ)的基因治療後引發強烈免疫反應并死亡,對整個基因治療領域都(dōu)産生(shēng)了深遠(yuǎn)影(yǐng)響[7]。另外,一部分(fēn)病毒載體(tǐ)(例如(rú)逆轉錄病毒和慢(màn)病毒)在感染人(rén)體(tǐ)細胞後,會将自(zì)身(shēn)基因片段插入宿主細胞的基因組DNA上,存在一定破壞宿主基因組結構完整性的風(fēng)險。
而更爲關鍵的是,在臨床開發中,LNP也好,病毒載體(tǐ)也好,用來(lái)做基因遞送都(dōu)面臨一個相(xiàng)同的技術(shù)難題:如(rú)何提高基因遞送的靶向性。就(jiù)是如(rú)何保證能把特定的基因片段投送到特定組織和器官、特定的細胞類型中,盡量避免對其他(tā)無關組織、器官和細胞類型的幹擾。
LNP的構成是各種脂類分(fēn)子(包括可(kě)電離(lí)脂質、膽固醇、磷脂和聚乙二醇化脂質分(fēn)子等)。在血液中LNP很容易和專門(mén)結合脂類分(fēn)子的載脂蛋白(bái)(ApoE, apolipoprotein E)結合,并被運載到肝髒。這也是爲什麽大(dà)多數LNP藥物會傾向于在肝髒中富集。
想要改變這種傾向性,一個思路(lù)是改變LNP的脂類分(fēn)子構成。例如(rú)2020年(nián)有研究發現,在LNP中添加某些帶有正/負電荷的脂類分(fēn)子,可(kě)以改變LNP表面的電化學特性,實現對肺部、脾髒、肝髒、肌肉等器官的一定程度的傾向性[8] [9]。另一個技術(shù)思路(lù)則是,在LNP上插入本身(shēn)就(jiù)具備細胞靶向性的分(fēn)子标記,爲LNP賦予更精确的投送能力。例如(rú)在LNP表面連接上專門(mén)識别CD4蛋白(bái)的抗體(tǐ),就(jiù)能将LNP定點投送到T細胞附近,因爲這些T細胞表面存在大(dà)量的CD4蛋白(bái)[10]。2023年(nián)1月發表的一項研究中,也有研究者們篩選得(de)到了一個能夠專一結合視網膜感光(guāng)細胞的肽段,将其插入LNP表面,就(jiù)能實現LNP對視網膜感光(guāng)細胞的靶向性投送[11]。
而針對病毒的改造方式就(jiù)更爲豐富。作(zuò)爲天生(shēng)的入侵者,病毒感染宿主細胞的過程,本身(shēn)就(jiù)具備一定的特異性:簡單來(lái)說(shuō)就(jiù)是特定病毒往往隻能感染特定生(shēng)物的特定細胞類型。
例如(rú)我們非常熟悉的人(rén)類免疫缺陷病毒(HIV),就(jiù)能夠專一感染人(rén)體(tǐ)特定種類的淋巴細胞。這是因爲HIV入侵宿主細胞需要借助這些淋巴細胞表面的兩個特征性蛋白(bái)質,CD4和CCR5[12]。事(shì)實上一種治療艾滋病的思路(lù)就(jiù)是利用基因編輯手段破壞人(rén)體(tǐ)免疫細胞的CCR5基因,從(cóng)而阻止HIV的感染[13]。類似的,新冠病毒感染人(rén)體(tǐ)細胞的過程,也依賴于新冠病毒表面的刺突蛋白(bái)與人(rén)體(tǐ)細胞表面的ACE2蛋白(bái)的結合[14]。
既然病毒天然就(jiù)具備細胞類型的精确靶向性,那麽我們自(zì)然可(kě)以想到,通過挑選合适的病毒,或者對已有的病毒載體(tǐ)進行改造,就(jiù)有可(kě)能讓它們精确靶向某一類我們所期待的細胞類型。
這方面進展最多的,可(kě)能是對AAV病毒載體(tǐ)的改造。AAV因其較低的免疫原性和成熟的生(shēng)産工(gōng)藝,被普遍看(kàn)作(zuò)是最有前途的基因遞送系統之一。天然存在的AAV載體(tǐ)因血清型不同已經體(tǐ)現出了一定程度(但(dàn)很有限)的器官選擇性,例如(rú)AAV1對肌肉組織、AAV8對肝髒、AAV9對肝髒、肺、和大(dà)腦組織等。但(dàn)很多研究者預計(jì),如(rú)果對AAV病毒的衣殼特征進行改造和篩選,有可(kě)能實現更精确的靶向性。例如(rú),通過對AAV表面蛋白(bái)質序列進行定向進化和篩選,研究者們發現了能夠定向感染中樞神經系統和周圍神經系統的新病毒載體(tǐ)[15][16]。利用類似思路(lù),研究者們也開發出了能夠感染大(dà)腦中一群特定的免疫細胞——小膠質細胞——的AAV載體(tǐ)[17]。在其他(tā)組織類型中,例如(rú)肌肉細胞[18]、内耳細胞[19]、T淋巴細胞[20]等等,近年(nián)來(lái)也有非常不錯的研究進展。
上述進展主要依賴于對病毒進行大(dà)規模的随機(jī)突變和反複篩選。而最近也有一項研究通過對病毒載體(tǐ)進行定向改造實現了對肌肉細胞的定向投送[21],展示了一種全新的改造病毒載體(tǐ)的思路(lù)。
簡而言之,這項研究利用了肌肉細胞一個天然屬性:骨骼肌細胞在發育過程中是獨立的細胞,但(dàn)在發育完成後會彼此融合形成粗大(dà)的肌纖維。這種細胞融合的過程依賴于肌肉細胞表面的特定融合蛋白(bái),如(rú)Myomaker和Myomerger。一個有趣的聯想是,肌肉細胞之間的融合,和有包膜病毒對宿主細胞的入侵,兩個迥然不同的生(shēng)物學過程卻都(dōu)涉及到細胞膜的融合過程。研究者們因此想到,如(rú)果把這些肌肉細胞融合蛋白(bái)插入有包膜病毒的表面,也能夠促進病毒載體(tǐ)和肌肉細胞的融合,實現對肌肉細胞的靶向投送。他(tā)們根據這個思路(lù)對慢(màn)病毒進行了改造,果然實現了對肌肉組織的高效識别和投送。
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蛋白(bái)質遞送系統
我們剛剛描述的基因遞送系統,主要的運輸對象是DNA/RNA這些核酸分(fēn)子,這些核酸分(fēn)子進入目的細胞後再生(shēng)産對應的蛋白(bái)質。需要注意的是,直接将蛋白(bái)質分(fēn)子投送到特定細胞内,往往也能實現類似的目的。
近年(nián)來(lái),也已經有一些蛋白(bái)質投送工(gōng)具被開發出來(lái)。一個特别值得(de)注意的方向仍然是利用病毒載體(tǐ)。這個技術(shù)路(lù)線的邏輯很簡單,将需要投送的蛋白(bái)質分(fēn)子直接連接在病毒顆粒中某個蛋白(bái)質分(fēn)子的末端即可(kě)。例如(rú)在2022年(nián),哈佛大(dà)學David Liu實驗室将單堿基基因編輯工(gōng)具蛋白(bái)通過一個肽段連接在逆轉錄病毒MMLV顆粒中,當類病毒顆粒進入宿主細胞後,堿基編輯工(gōng)具被釋放(fàng)出來(lái),可(kě)以對宿主細胞的特定基因進行編輯[22]。
在2023年(nián)3月,布羅德研究所張鋒實驗室開發了一套全新的蛋白(bái)質遞送系統,這套系統具備了精确靶向性的巨大(dà)潛力[23]。這套全新遞送系統的學習對象不是病毒,而是細菌。更精确的說(shuō),是很多細菌中存在的可(kě)收縮注射系統(eCIS,extracellular contractile injection system)。
我們可(kě)以吧(ba)細菌的eCIS系統看(kàn)成是一套細菌生(shēng)産和釋放(fàng)的微型注射器,其外形是大(dà)約100納米長、可(kě)收縮的針管狀結構。細菌在入侵和感染宿主的時候,可(kě)以批量釋放(fàng)這些微型注射器,它們可(kě)以結合在宿主細胞膜上,刺破細胞膜,将針管内部的蛋白(bái)質注射到細胞内部,幹擾細胞的生(shēng)存和活動,爲細菌入侵和繁殖提供幫助[24]。
張鋒實驗室就(jiù)試圖改造和利用這套天然存在的蛋白(bái)質投送系統。他(tā)們将發光(guāng)杆菌中負責制造eCIS的完整基因序列(包含16個基因,pvc1-16)導入大(dà)腸杆菌中,從(cóng)而批量生(shēng)産和組裝出這種微型注射器。當然,想要這套系統發揮作(zuò)用,真正重要的是是否能對它進行兩個方面的改造:是否可(kě)以随意替換eCIS的投送蛋白(bái),以及是否可(kě)以改造eCIS以實現對特定細胞類型的投送。
首先研究者們證明,這種微型注射器具體(tǐ)注射什麽蛋白(bái)質進入細胞,确實是可(kě)以人(rén)爲改造的。隻需要eCIS基因序列上編碼被投送蛋白(bái)的相(xiàng)應片段,更換爲需要被投送的蛋白(bái)質基因序列即可(kě),例如(rú)基因編輯工(gōng)具cas9,綠色熒光(guāng)蛋白(bái)GFP,重組蛋白(bái)Cre等等。
其次,研究者們發現eCIS的其中一個組成部分(fēn),pvc13蛋白(bái),可(kě)能和微型注射器對宿主的識别相(xiàng)關。這個蛋白(bái)位于微型注射器的針頭位置附近,直接和宿主細胞表面相(xiàng)接觸。因此,如(rú)果改造pvc13蛋白(bái)的構造,讓它能結合特定細胞類型的表面蛋白(bái)質,也許就(jiù)可(kě)以實現eCIS的細胞靶向性。例如(rú),如(rú)果在pvc13蛋白(bái)上接上一個能夠結合人(rén)體(tǐ)細胞表面EGFR蛋白(bái)的肽段,改造後的微型注射器就(jiù)可(kě)以結合人(rén)體(tǐ)細胞,并将注射器内部的蛋白(bái)質注射進入人(rén)體(tǐ)細胞内部。
在上述兩層改造完成後,細菌天然存在的eCIS系統就(jiù)被升級成了一套能夠定向向特定細胞注射特定蛋白(bái)質分(fēn)子的基因遞送系統。研究者們還(hái)進一步證明了這套系統還(hái)能在小鼠體(tǐ)内(包括大(dà)腦中)發揮功能。
相(xiàng)比投送DNA/RNA基因片段,直接投送蛋白(bái)質分(fēn)子的一個潛在好處是,蛋白(bái)質分(fēn)子進入細胞後往往會被快(kuài)速降解,在細胞内存在和發揮功能的時間有限,可(kě)能可(kě)以避免對細胞功能長時間的幹擾和破壞。因此我們可(kě)以想象,在不同的應用場景下,DNA/RNA遞送系統和蛋白(bái)質遞送系統可(kě)能會體(tǐ)現不同的獨特價值。
在這裡(lǐ)請(qǐng)允許我稍作(zuò)總結:很多人(rén)類疾病都(dōu)和特定基因的缺陷或過度活躍直接相(xiàng)關,因此如(rú)果能利用基因遞送系統,直接操縱這些基因的開關,将能夠幫助我們直接幹預和治療這些疾病。而因爲這些緻病基因的活動幾乎總是具有時空特異性——也就(jiù)是隻在特定時間、特定細胞類型中發揮作(zuò)用,因此基因遞送系統也相(xiàng)應的需要具備操控的時空精确性。
不管是基于LNP、基于病毒載體(tǐ)、還(hái)是基于eCIS的基因遞送系統,在這些方面都(dōu)還(hái)大(dà)有潛力可(kě)挖,大(dà)有機(jī)會可(kě)以抓住。
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參考資料
[1]https://www.modernatx.com/research/product-pipeline
[2]https://aacrjournals.org/clincancerres/article/26/23/6284/83111/Intratumoral-IL12-mRNA-Therapy-Promotes-TH1
[3]https://www.nejm.org/doi/10.1056/NEJMoa2107454?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
[4]https://www.science.org/doi/10.1126/science.256.5058.808
[5]https://ashpublications.org/blood/article/101/7/2563/106703/Persistence-and-expression-of-the-adenosine
[6]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35347281/
[7]https://www.sciencehistory.org/distillations/the-death-of-jesse-gelsinger-20-years-later
[8]https://www.nature.com/articles/s41565-020-0669-6
[9]https://www.nature.com/articles/s41467-020-17029-3
[10]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34091054/
[11]https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.add4623
[12]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19339947/
[13]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31509667/
[14]https://www.nature.com/articles/s41586-020-2012-7
[15]https://www.nature.com/articles/s41593-021-00969-4
[16]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35643078/
[17]https://www.nature.com/articles/s41592-022-01547-7
[18]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34506722/
[19]https://www.nature.com/articles/s41467-019-11687-8
[20]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36638795/
[21]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37075755/
[22]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35021064/
[23]https://www.nature.com/articles/s41586-023-05870-7
[24]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30905475/
文章(zhāng)來(lái)源:微信公衆号 “王王王立銘”
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